تشخیص فوق العاده رپید در محل عفونت SARS-COV-2 با استفاده از الگوریتم طیف سنجی و تجزیه و تحلیل ساده ATR-FTIR: حساسیت و ویژگی بالا

نیاز فوری به رژیم های آزمایش فوق العاده رپید برای تشخیص عفونت های ویروس SARS-COV-2 [سندرم حاد تنفسی شدید Coronavirus 2] در مدت زمان واقعی در عرض چند ثانیه وجود دارد تا جلوی گسترش آن را بگیرد. رویکردهای آزمایش فعلی برای این ویروس RNA در درجه اول بر تشخیص توسط RT-qPCR متمرکز است ، که به دلیل نیاز به پردازش آزمایشگاهی ، وقت گیر ، پرهزینه ، غالباً نادرست و غیر عملی است. تأخیر تا رسیدن نتیجه آزمایش با بیمار منجر به گسترش ویروس بیشتر شده است. علاوه بر این ، آخرین آزمایشات سریع آنتی ژن هنوز به 15 تا 30 دقیقه پردازش نیاز دارد و برای انجام آن چالش برانگیز است. علیرغم افزایش تلاشهای آزمون PCR و آزمون آنتی ژن ، این بیماری همه گیر وارد مرحله دوم جهانی شده است. در اینجا ، ما از یک رویکرد عاری از معرف و غیر مخرب از ضعف بازتاب کل بازتاب مادون قرمز (ATR-FTIR) با تجزیه و تحلیل شیمیایی متعاقب آن به بازجویی از نمونه های آلوده به ویروس استفاده کردیم. نمونه های متضاد با ذرات ویروس COVID-19 با تابش گاما در سطح پایین به 1582 نسخه در میلی لیتر در میلی لیتر مادون قرمز تولید شده (IR) با نسبت سیگنال به نویز خوب. قله های طیفی ویروس غالب با نوارهای اسید نوکلئیک ، از جمله RNA همراه است. در تعداد کپی کم ، وجود ذرات ویروس قادر به اصلاح امضای طیفی IR بزاق بود ، مجدداً با تبعیض آمیز موجها در درجه اول با RNA همراه است. تبعیض همچنین به دنبال تجزیه و تحلیل طیفی ATR-FTIR از سواب های غوطه ور در بزاق به طور متفاوتی با ویروس قابل دستیابی بود. در ادامه ، ما سیستم آزمایش خود را در یک محیط بالینی قرار دادیم که در آن شرکت کنندگان برای ارائه جزئیات جمعیتی ، علائم ، آزمایش موازی RT-QPCR و دستیابی به سواب های حلق برای تجزیه و تحلیل طیفی ATR-FTIR استخدام شدند. طبقه بندی اولیه نمونه های سواب به عفونت منفی در مقابل COVID-19 بر اساس علائم و نتایج PCR بود. پس از آموزش و اعتبارسنجی الگوریتم تجزیه و تحلیل تبعیض آمیز الگوریتم-خطی (GA-LDA) ، حساسیت کور 95 ٪ و ویژگی 89 ٪ به دست آمد. این رویکرد سریع در طی دو دقیقه نتایج حاصل می کند و در مناطقی با افزایش ترافیک افراد قابل استفاده است که به نتایج آزمایش ناگهانی مانند فرودگاه ها ، رویدادها یا کنترل دروازه نیاز دارند.

معرفی

در اوایل سال 2020 ، یک فشار جدید از Coronavirus به نام SARS-COV-2 (سندرم حاد تنفسی حاد Coronavirus 2) ، که بیشتر به عنوان ایجاد بیماری COVID-19 شناخته می شود ، باعث بیماری جهانی شد (1). این ویروس با شروع شیوع اپیدمی در ووهان (چین) به سرعت به سمت غرب به سمت اروپا و ایالات متحده (2) با پیامدهای جدی و اجتماعی و اقتصادی در سراسر جهان گسترش یافت (3). SARS-COV-2 تمایل بالایی برای گسترش عفونی در کل جمعیت نشان می دهد (2). هر مورد مثبت COVID-19 ، اگر موجود نباشد ، می تواند به راحتی در دو یا چند نفر که شماره R ویروسی دارند (4) گسترش یابد. برخی از کشورها ، مانند کره جنوبی ، در ابتدا با موفقیت با شیوع Covid-19 مبارزه کردند. این مبتنی بر جنبه های اصلی (5) از: (الف) پیشگیری ، از طریق شیوه های تمیز کردن خوب و انزوا در موارد بالقوه است.(ب) آزمایش ، برای شناسایی افراد آلوده و دقیقاً موارد خطرناک. و (ج) درمان ضد ویروسی و در آینده واکسن. آزمایش برای شناسایی افراد آلوده و مناطق ریسک اساسی است (6). این می تواند انزوا هوشمندانه مناطق را بدون تأثیرگذاری بر اقتصاد کل کشور امکان پذیر کند و به تخصیص منابع اجازه دهد تا از لحاظ استراتژیک بیشتر با این بیماری مبارزه کنند ، با دستگاه های تهویه بیشتر ، داروها و کادر پزشکی که به مناطقی با موارد تشخیص داده شده بیشتر اختصاص می یابد.

The main challenges for testing are the cost and in particular time. Gold-standard diagnosis by RT-qPCR is costly with a shortage of testing facilities even in developed countries and can take>2 روز برای به دست آوردن نتیجه ، زیرا نمونه ها برای پردازش به آزمایشگاه های غالباً دوردست منتقل می شوند (7). این برای آزمایش انبوه مناسب نیست (8). علیرغم افزایش تلاشهای آزمایشی PCR ، این بیماری همه گیر متوقف نشده است. در مقابل ، عود و موج دوم این بیماری وجود دارد ، زیرا بسیاری از بیماران عفونی در حالی که منتظر نتایج آزمون PCR هستند ، این بیماری را گسترش می دهند. برخی از شرکت ها بر اساس سنسورهای جدید تست های سریعتر و کم هزینه تری انجام می دهند (9). رویکردهای جایگزین آنتی ژن یا آنتی بادی جایگزین تحت تأثیر ویژگی کم قرار دارند (یعنی بیماران سالم می توانند به اشتباه به عنوان Covid-19 مثبت طبقه بندی شوند) بنابراین باعث ایجاد تعصب آماری می شوند که می تواند مستقیماً بر سیاست های بهداشت عمومی تأثیر بگذارد (10). بنابراین ، نیاز به توسعه رویکردهای آزمون COVID-19 وجود دارد که می تواند نتایج را در زمان واقعی و در محل ارائه دهد.

طیف سنجی ارتعاش ، از جمله طیف سنجی مادون قرمز ترانسفورماتور فلور برای ترانسفورماتور کل (ATR-FTIR) ، به طور گسترده ای برای تمایز و طبقه بندی جمعیت طبیعی و پاتولوژیک با استفاده از انواع مختلف سلول ، بافت ها یا بیوفلوئیدها استفاده شده است (11-13). بیوفلوئیدهای به راحتی در دسترس ، مانند پلاسما خون/سرم ، بزاق یا ادرار ، به دلیل روشهای روتین جمع آوری و همچنین حداقل تهیه نمونه برای اجرای بالینی ایده آل هستند (14). بازجویی از نمونه ها با تکنیک های طیف سنجی مادون قرمز (IR) امکان تولید "اثر انگشت طیفی" را فراهم می کند که متعاقباً تبعیض جمعیت های مختلف و شناسایی نشانگرهای زیستی بالقوه را تسهیل می کند (15). در چند سال گذشته ، طیف سنجی ATR-FTIR مبتنی بر بیوفلوئید برای تشخیص ، غربالگری یا نظارت بر پیشرفت/رگرسیون در انواع بیماری ها استفاده شده است (16). تکنیک های طیف سنجی سریع ، مقرون به صرفه و غیر مخرب است که آنها را به عنوان کاندیدای مناسبی برای ترجمه به کلینیک تبدیل می کند.

به عنوان یک بیوفلوئید غیر تهاجمی به راحتی در دسترس ، بزاق یک کاندیدای ایده آل برای تسهیل در تشخیص بیماری است. در واقع ، سلامت دهان و دندان مدتهاست که شاخصی از سلامت کامل ارگانیسم است (17). در اینجا ، از طیف سنجی ATR-FTIR برای بازجویی از نمونه های بزاق در سواب حلق که از افراد با یا بدون عفونت مشکوک به COVID-19 استفاده شده است ، استفاده شد. بر خلاف بسیاری از آزمایشات که با استفاده از نمونه های متضاد مبتنی بر آزمایشگاه انجام شده است ، ما رویکرد در تنظیمات بالینی را بر روی نمونه های دنیای واقعی تدوین کردیم. هدف ما تمایز افراد با عفونت فعال بر اساس یک سری نشانگرهای زیستی طیفی بود. ما همچنین علائم و سایر ویژگی های جمعیتی شرکت کنندگان خود را به عنوان عوامل مخدوش در نظر گرفتیم. ما یک روش جدید و فوق العاده رپید در محل را برای شناسایی COVID-19 بر اساس سواب های حلق با استفاده از نور IR ، با پتانسیل اجرای آماده در تنظیمات جمعیت عمومی پیشنهاد می کنیم.

نتایج و بحث

سنبله بزاق با ویروس غیرفعال Covid-19

شکل 1A طیف معمولی از ذرات ویروس COVID-19 با اشعارگر غیرفعال شده را نشان می دهد (E SARS. COV2/SP02. 2020. HIAE. BR شماره الحاق GenBank MT 126808. 1) (18) ؛در 1582 نسخه در میلی لیتر ، یک طیف ATR-FTIR با نسبت سیگنال به نویز خوب (SNR) بدست می آید. این به منظور ارزیابی حد تشخیص (LOD) برای بیوسکوکتروسکوپی برای مشخص کردن حداقل غلظت که ویروس توسط طیف سنجی IR قابل تشخیص است. در زیر این سطح ، SNR ضعیف و پر سر و صدا می شود. این به وضوح به توانایی طیف سنجی ATR-FTIR برای استخراج یک اثر انگشت ویروسی منحصر به فرد سازگار با ویژگی های طیفی مرتبط با یک طیف ویروس خالص اشاره دارد. جالب است بدانید که قله های طیفی غالب با نوارهای اسید نوکلئیک از جمله RNA همراه هستند. پس از استخراج اسید نوکلئیک (RNA/DNA) از نمونه های بزاق به دست آمده از شرکت کنندگان یا مثبت (5 نفر) یا منفی (5 نفر) برای COVID-19 ، یک تفکیک واضح از نقاط داده طیفی با استفاده از تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی اکتشافی بدست می آید (PCA) (شکل 1b).

• شکل دانلود
• در برگه جدیدی باز کن

شکل 1.

آ. طیف ویروس خالص در بزاق (کل ویروس غیرفعال شده توسط رادیو گاما) (E Sars. Cov2/SP02. 2020. HIAE. BR شماره الحاق GenBank MT 126808. 1). ب. نمایش گرافیکی جداسازی نمونه مثبت و منفی در نمونه های RNA استخراج شده برای PCR که توسط بیوسوسکتروسکوپی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته است.

کنترل بزاق از یک شرکت کننده انسانی (مرد ، 42 سال و RT-qPCR منفی) با تعداد مختلفی از ذرات ویروس Covid-19 گاما غیرفعال شده (شکل 2) سنبله شد. در تعداد کپی کم ، ذرات ویروس به وضوح قادر به اصلاح امضای طیفی مادون قرمز بزاق است (شکل 2A و 2B). بررسی بزاق کنترل در مقایسه با ذرات ویروس غیرفعال شده بزاق در سطح کپی مختلف ، توانایی تشخیص تغییرات طیفی ناشی از ذرات ویروس را در سطحی که در حفره حلق انسان آلوده بسیار کم در نظر گرفته می شود (علامت یا علامت گذاری) است. حتی بیشتر قانع کننده تر ، هنگامی که این مورد با استفاده از تجزیه و تحلیل اساسی چند متغیره (یعنی ، PCA) مورد بررسی قرار می گیرد ، امضای طیفی IR از ویروس غیرفعال خالص به دور از بزاق کنترل در یک طرح نمرات (شکل 2C). هنگامی که بزاق با سطح ویروس فوق العاده کم (781 نسخه در میلی لیتر ؛ خوشه A1 در زیر) سنبله می شود ، همزمان نقاط طیفی با نقاط طیفی کنترل کننده بزاق کنترل وجود ندارد. با این حال ، در سطح 12. 500 نسخه در میلی لیتر (خوشه A2 در زیر) ، تفکیک به دور از کنترل وجود دارد. توجه به این نکته ضروری است که طرح بار به طور خاص RNA را متناسب با سطح ویروس مشخص می کند (شکل 2B). بارهای موجود در PC1 باندهای مسئول افزایش غلظت ویروس (باند اسید نوکلئیک) را نشان می دهد ، و بارهای موجود در PC2 باندهای مسئول تبعیض بین بزاق و ویروس را نشان می دهد (گروههای آمید I و آمید II موجود در بزاق اما ویروس نیستند). سایر باندهای مرتبط با پروتئین ، بزاق را از ویروس تبعیض می کنند-ما معتقدیم که این اولین گزارش از نوع خود با استفاده از بیوسکوکتروسکوپی است.

• شکل دانلود
• در برگه جدیدی باز کن

شکل 2.

(الف) طیفهای خام متوسط و (ب) طیفهای از پیش پردازش شده برای بزاق (2 نفر) ، ویروس خالص Covid-19 در غلظت های مختلف (28 نفر ، 10 × 10 5-98 کپی در میلی لیتر) و ویروس بزاق +در غلظت های مختلف (63 نفر ، 5 × 10 5-24 نسخه در میلی لیتر).(ج) نمرات PCA و (د) بارهای PCA در PC1 vs. PC2 برای داده های از پیش پردازش شده. inset C1: مخلوط بین بزاق و ویروس بزاق + برای غلظت کم (781 ≤ نسخه در میلی لیتر). C2: بین ویروس خالص و ویروس بزاق + برای غلظت بالا (10 × 1. 25 4 4 نسخه در میلی لیتر) مخلوط کنید. پیش پردازش: هموار سازی Savitzky-Golay (SG) (پنجره 7 نقطه ، اتصالات چند جمله ای سفارش دوم) و تصحیح پایه. بارهای موجود در PC1 باندهای مسئول افزایش غلظت ویروس (باند اسید نوکلئیک) را نشان می دهد ، و بارهای موجود در PC2 باندهای مسئول تبعیض بین بزاق و ویروس را نشان می دهد (گروههای آمید I و آمید II موجود در بزاق اما ویروس نیستند).

علاوه بر این ، در محیط پیچیده یک نمونه بزاق ، که بدون شک حاوی طیف وسیعی از ترکیبات پیچیده از جمله مواد سلولی آبی ، لایه برداری ، ایمونوگلوبولین های پس از عفونت مانند IGA و سایر عوامل فردی یا آلوده کننده است ، یک روش شیمیایی چند متغیره هنوز می تواند ویروس را استخراج کندویژگی های تبعیض آمیز مرتبط. پس از این ، شکل 3 تجزیه و تحلیل سواب های پیچیده شده با بزاق با یا بدون سنبله با ذرات ویروس COVID-19 گاما را نشان می دهد. شکل 3A و 3B طیف با SNR خوب را نشان می دهد. در نتیجه نمرات PCA نمرات ، نقاط داده های طیفی برای سواب های بزاق ویروس جدا شده از سواب جدا می شوند یا دسته های سواب بزاق را کنترل می کنند (شکل 3C). این در شماره های کپی کم حاصل می شود. بارهای موجود در PC1 باندهای مسئول جدایی بین SWAB + بزاق و SWAB + SALIVA + ویروس (Amide I و Amide II Proteins) و بارهای موجود در PC2 گروههای مسئول تغییر غلظت ویروس را نشان می دهد (آمید اول ، آمید IIو باند اسیدهای نوکلئیک) (شکل 3D). متفاوت از بزاق ، نمونه سواب حاوی نوارهایی در منطقه اسیدهای نوکلئیک به علاوه آمید I و Amide II است که ممکن است از خود بزاق باشد.

• شکل دانلود
• در برگه جدیدی باز کن

شکل 3.

(الف) طیفهای خام متوسط و (ب) طیفهای از پیش پردازش شده برای سواب + بزاق (5 نفر) ، و سواب + بزاق + ویروس (54 نفر = 54 ، 10 5-98 کپی/میلی لیتر).(ج) نمرات PCA و (د) بارهای PCA در PC1 vs. PC2 برای داده های از پیش پردازش شده. inset C1: غلظت ویروس در حدود 10 × 10 3 3 نسخه در میلی لیتر. C2: غلظت ویروس در حدود 1. 56 × 10 3 نسخه در میلی لیتر ؛C3: غلظت ویروس 781 کپی/میلی لیتر. پیش پردازش: هموار سازی Savitzky-Golay (SG) (پنجره 7 نقطه ، اتصالات چند جمله ای سفارش دوم) و تصحیح پایه. بارهای موجود در PC1 باندهای مسئول جدایی بین SWAB + بزاق و SWAB + SALIVA + ویروس (Amide I و Amide II Proteins) و بارهای موجود در PC2 گروههای مسئول تغییر غلظت ویروس را نشان می دهد (آمید اول ، آمید IIو باند اسیدهای نوکلئیک). متفاوت از بزاق ، نمونه سواب حاوی نوارهایی در منطقه اسیدهای نوکلئیک به علاوه آمید I و Amide II است که ممکن است از خود بزاق باشد.

تفکیک ga-lda از دسته ها: Covid-19 آلوده در مقابل آلوده نشده

طبقه بندی به دسته های منفی (تعیین نشده توسط COVID-19) و مثبت (تعیین شده به عنوان آلوده) بر اساس یک سری از آزمایشات RT-QPCR از جمله پروتکل برلین (18) در درجه اول در آزمایشگاه مرکزی ایالت اسپریتو سانتو در کنار علائم انجام شد./نتیجهپیگیری نشان داد که شرکت کنندگان COVID-19 نیاز به بستری شدن دارند. CT

• شکل دانلود
• در برگه جدیدی باز کن

شکل 4.

qRT-PCR of samples. A tiered RT-qPCR system including the Berlin protocol was employed for the analyses of parallel naso-pharyngeal samples taken from study participants. a . The samples were considered positive if the E gene amplified with Ct b . A standard curve is below alongside a negative control. c . The efficiency curve to determine the threshold is shown. d . Three positive samples are shown juxtaposed with three negative samples (no amplification) and three with a Ct>37 (منفی/بی نتیجه).

تکنیک شیمیایی الگوریتم ژنتیکی تجزیه و تحلیل تبعیض آمیز (GA-LDA) به سمت طبقه بندی (19 ، 20) از منفی در مقابل مثبت برای عفونت COVID-19 استفاده شد (شکل 5). نسبت طبقه بندی به دست آمده پس از GA-LDA حساسیت 95 ٪ و ویژگی 89 ٪ (جدول 1) بود. شکل 5a و 5b طیف های خام کامل را در کل دامنه طیفی Mid-IR و طیف های خام در ناحیه اثر انگشت برای همه نمونه های سواب مثبت منفی و COVID-19 نشان می دهد (111 نفر = n و 70 مثبت). طیف ها از قبل پردازش شده [هموار سازی Savitzky-Golay (پنجره 9 نقطه ، اتصالات چند جمله ای مرتبه دوم) ، حداقل مربعات حداقل مربعات با وزن اتوماتیک و عادی سازی بردار] در ناحیه اثر انگشت (شکل 5C). آموزش و اعتبار سنجی GA-LDA با استفاده از 50 منفی و 50 مثبت انجام شد. نمرات نمرات GA-LDA برای مجموعه اعتبار سنجی (61 نفر = n و 20 مثبت) در شکل 5D نشان داده شده است.

• مشاهده خطی
• مشاهده پنجره
• دانلود پاورپوینت

میز 1.

ماتریس سردرگمی و ارقام شایستگی برای مجموعه اعتبار سنجی با استفاده از الگوریتم GA-LDA قبل از پردازش.